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Scientific Reports 12권, 기사 번호: 12746(2022) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

THC(전체 홀로그램 특성화)는 세포 생존 가능성을 정확하게 식별하는 효율적이고 자동화된 라벨 없는 방법으로 여기에서 제시됩니다. THC는 로렌츠-미(Lorenz-Mie) 광산란 이론을 사용하여 개별 입자의 크기와 굴절률을 결정하는 단일 입자 특성화 기술입니다. 생물학적 제제 제조를 포함한 많은 응용 분야에서 세포 생존 가능성을 평가하는 것이 어려운 일이지만, 전통적인 접근 방식에는 염료를 사용한 신뢰할 수 없는 라벨링 및/또는 수동으로 세포를 계산하는 시간 소모적인 방법이 포함되는 경우가 많습니다. 이 연구에서 우리는 시간의 함수로서 다양한 농도의 이소프로판올 존재 하에서 Saccharomyces cerevisiae 효모의 생존력을 측정했습니다. 모든 THC 측정은 희석이나 라벨 추가 없이 샘플의 기본 환경에서 수행되었습니다. 평면파 조명이 있는 40\(\times\) 대물렌즈를 사용하는 인라인 홀로그램 현미경으로 홀로그램 측정을 수행했습니다. 우리는 THC를 사용한 결과를 트리판 블루 염료와 구별되는 살아있는 세포와 죽은 세포의 수동 계산과 비교했습니다. 우리의 연구 결과는 THC가 개별 세포의 굴절률을 통해 살아있는 효모 세포와 죽은 효모 세포를 효과적으로 구별할 수 있음을 보여줍니다.

효모 세포, 특히 Saccharomyces cerevisiae의 사용은 세포 기반 실험에서 단백질 제조에 이르기까지 업계와 학계1,2,3 어디에서나 사용됩니다. 예를 들어, 의학 연구에서 효모는 암과 관련된 유전적 돌연변이를 연구하는 모델 유기체 역할을 합니다4,5,6. 바이오의약품 연구 및 제조에서 효모 세포는 관심 있는 단백질 생산을 위한 미니 공장으로 사용됩니다7,8,9. 또한, 가장 잘 알려진 응용 분야 중 하나에서 효모는 소비재 연구 및 제조에 사용되어 맥주, 와인 및 빵 제조를 최적화합니다10,11,12,13.

세포 생존 가능성은 이러한 많은 응용 분야에서 중요한 관심 매개변수입니다. 효모의 생존력을 측정하는 다양한 방법이 존재하지만 대부분은 염료로 세포를 염색해야 한다는 한 가지 제한 사항을 공유합니다. 트리판 블루(TB) 배제 분석과 같은 염료 기반 방법은 염료에 불투과성인 건강한 세포막에 의존하는 반면, 죽거나 손상된 세포의 막은 염료가 세포 내로 확산되도록 합니다. 이 방법은 유용하지만 일반적으로 지루한 시료 준비와 수동 세포 계수가 필요합니다. 수동 셀 카운팅은 통계가 낮고 인적 오류가 발생하기 쉽습니다. 또한, 결핵 배제 분석은 생존 가능성을 과대평가하고 생존 가능성이 70%-80% 미만인 특정 세포 샘플에 대해 신뢰할 수 없는 것으로 나타났습니다.

또한 염료 기반 염색 생존율 측정에서는 염료가 의도하지 않은 방식으로 세포 또는 다른 실험 변수와 상호 작용할 수 있는 위험이 있습니다. 예를 들어, 트리판 블루는 세포와 부정적으로 상호 작용하여 종종 세포를 파열시켜 생존력 측정을 신뢰할 수 없게 만드는 것으로 나타났습니다. 라벨 기반 생존 가능성 분석의 단점은 잘 알려져 있지만 라벨이 없는 대안은 거의 존재하지 않습니다.

이 연구에서는 THC(Total Holographic Characterization®)를 사용하여 효모의 생존 가능성을 안정적으로 측정하는 라벨 없는 자동화 기술을 소개합니다. THC는 현탁액에서 눈에 보이지 않는 입자를 감지, 계산 및 특성화하기 위해 개발된 홀로그램 비디오 현미경을 기반으로 하는 기술입니다21. 여기서 우리는 THC를 구현하고 홀로그램 현미경과 미세 유체 샘플 처리를 결합하여 입자 크기와 굴절률의 정확한 측정을 제공하는 xSight를 사용하여 효모 생존성을 평가했습니다. 일회용 미세 유체 샘플 칩을 사용하면 샘플 간 교차 오염이 없으며 청소가 필요하지 않습니다. 각 측정은 자동화되어 있으며 완료하는 데 약 15분이 소요됩니다.